配液

選擇好一定比例的各種溶劑，量取特定體積，加入到干凈分液漏斗中，搖勻（搖勻過程中注意放氣），靜置10min左右。

如我們配制正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水（1：1：1：1,v/v）的液體約200mL，分別量取50mL正己烷，乙酸乙酯，甲醇，水加入分液漏斗搖勻，靜置即可。

分液

將分層好的上下兩相分別盛入兩個干凈的試劑瓶中。

脫氣

將分別盛有上下兩相的液體的試劑瓶放入超聲脫氣機(jī)中，脫氣20min。這一步主要是為了防止在高速逆流色譜儀工作的過程中產(chǎn)生氣泡。

平衡

首先開啟水浴保證溫度，然后將固定相以一定流速泵入色譜儀中，待到出液口有液體流出即可。使機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)，再以一定流速泵入流動相。當(dāng)出液口有流動相流出時，即達(dá)到平衡。

進(jìn)樣

停泵，將六通閥旋轉(zhuǎn)到load端，用注射器（哈哈，不是進(jìn)樣器，普通注射器即可）將六通閥內(nèi)空氣吹盡，抽取樣品（樣品用流動相或固定相溶解），樣品充滿整個進(jìn)樣圈即可。然后將六通閥旋轉(zhuǎn)到inject端，開泵，同時檢測器開始記錄。

收集

按要求收集餾分即可。

后處理

一般采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干即可。

逆流色譜的應(yīng)用

逆流色譜的應(yīng)用主要有天然植物有效成分分離，海洋生物活性成分的分離，抗生素分離，蛋白質(zhì)分離等等。